Moderní éra profesionálního fotbalu začala v západním New Yorku 28. října 1959 se vznikem klubu Buffalo Bills a jeho zařazením jako sedmého celku do nově vznikající AFL – American Football League. Vlastníkem a zakladatelem klubu byl Ralph C. Wilson. Bills za dobu své existence v AFL a od roku 1970 NFL střídali dlouhá období špatných výsledků s kratšími údobími, ve kterých se jim dařilo. Svá domácí utkání hráli Bills na městském stadiónu Civic Stadium, později War Memorial Stadium, na kterém byla v průběhu 13 let zvýšena divácká kapacita z původních 26 tisíc na pozdějších bezmála 46 tisíc.

První výrazný úspěch Bills zaznamenali v roce 1963, ve své čtvrté sezóně. Po základní části se dělili o první místo ve východní divizi AFL, ale v playoff podlehli rivalům Boston Patriots. Vše si vynahradili ve dvou následujících sezónách, 1964 a 1965 , ve kterých se jim podařilo nejen získat korunu divizního krále, ale dvakrát po sobě také porazili v mistrovském zápase tým San Diego Chargers a stali se šampiony AFL. Kouč Lou Saban byl během svého působení u týmu Bills pokaždé zvolen trenérem roku AFL (AFL Coach of the Year) a to až do svého odchodu po sezóně 1965.

Titulový zápas v sezóně 1966 Buffalo prohrálo s týmem Kansas City Chiefs a propáslo tak příležitost vyzvat k souboji vítěze NFL v premiérovém Super Bowlu. V následujících letech se Bills propadli do šedi průměru a podprůměru, v pěti sezónách vyhráli jen 13 duelů a dvakrát se o vítězi nerozhodlo, zatímco ze hřiště odcházeli poraženi v 55 případech. V roce 1972 se do Buffala vrátil trenér Saban. Ofenzívu Buffala postavil na největší hvězdě týmu, running backovi O.J. Simpsonovi. Bills se stali znovu konkurenceschopní. Největším úspěchem tohoto období bylo ustavení neopakovatelného individuálního rekordu O.J. Simpsona – 2.003 naběhaných yardů během 14 zápasů sezóny 1973.

V polovině probíhající sezóny 1976 ale Saban od týmu odešel a Bills znovu zabředli do výsledkové mizérie. Oživení přinesl až nový kouč Chuck Knox, který s Bills získal v roce 1980 titul ve východní divizi americké konference (AFC Eastern division). Postoupit v playoff přes Cincinnati se ale Buffalu nepodařilo. Následovalo bezútěšné období poloviny 80-tých let a šesti po sobě jdoucích sezón, ve kterých se museli buffalští fanoušci pokaždé smířit se zápornou zápasovou bilancí.

Nicméně, v roce 1986 se trenérské taktovky ujal legendární kouč Marv Levy a z Bills, společně s generálním manažerem Bill Polianem, vytvořil tým, který zaujal dominantní postavení v Americké fotbalové konferenci. Počínaje rokem 1988 vyhráli Bills pět divizních titulů během šesti let a stali se historicky jediným týmem, který čtyřikrát v nepřetržité řadě hrál Super Bowl. Po žádném z nich si bohužel hráči Bills nenechávali vyrobit památeční prsteny pro vítěze.

Modro-červeno-bílý dres Bills během uplynulých 57 sezón oblékala dlouhá řada vynikajících hráčů. Za úspěchy mistrovského týmu šedesátých let stojí, mimo jiné, pozdější US kongresman, qurterback Jack Kemp, fullback Cookie Gilchrist, defenzívní tackle Tom Sestak nebo guard Billy Shaw. V sedmdesátých letech byla výjimečná běhová hra Bills postavena nejen na výkonech již zmiňovaného O.J. Simpsona, ale také na tvrdé práci hráčů O-line z takzvané „Electric company“, v níž prim hráli guardi Joe DeLamielleure a Reggie McKenzie. Přelom osmdesátých a devadesátých let je považován za zlaté období buffalského fotbalu a tehdejší tým za nejlepší tým NFL všech dob, který se nikdy nedočkal korunovace. Tato generace představila mimořádné hráče na všech pozicích, ale fanoušci si nejčastěji s úspěchy pojí quarterbacka Jim Kellyho, running backa Thurman Thomase, wide receivera Andre Reeda a defenzívního enda Bruce Smithe.

Poslední účast Buffala v playoff se datuje rokem 2000 (sezóna 1999). O výhru nad týmem Tennessee Titans a postup přišli hráči Bills v poslední akci zápasu, později pojmenované jako „Music City Miracle“. Od té doby čekají fanoušci nejen na větší úspěch, ale 17 let nového millénia také na postup do posezónních vyřazovacích bojů.

Buffalo Bills se v roce 1973 přestěhovali z War Memorial Stadium na nově postavený Rich Stadium, dnes New Era Field, v předměststé části Orchard Park.

V roce 2014 zemřel zakladatel a jediný vlastník klubu Ralph C. Wilson. Odkoupením licence se novými vlastníky stali místní patrioti Kim a Terry Pegulovi.